棉花爛鈴病是一類由真菌或細菌引起的棉鈴病 害，包括疫病、紅腐病、炭疽病、黑果病、紅粉病、角斑 病、軟腐病、曲霉病、灰霉病和黑斑病等10余種（過 崇儉和羅張，1963；棉花鈴病聯(lián)合調(diào)查組，1986）。棉 鈴疫病是我國各主要產(chǎn)棉區(qū)棉花鈴期的主要病害， 其發(fā)病率和危害性居各種爛鈴病之首（沈其益， 1992；李社增等，2017），嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和 品質(zhì)。

供試病原菌、菌株和植物：棉鈴疫病病原菌菌株 JP5-1，自河北省滄州市獻縣河城街鎮(zhèn)河城街村罹病 棉鈴上分離，在棉鈴上表現(xiàn)為強致病力，由河北省農(nóng) 林科學(xué)院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室 保存。在河北省邯鄲市、邢臺市棉田，辛集市玉米 田，定興縣番茄田和保定市黃瓜田分別采集作物根 圍土壤，采用常規(guī)系列稀釋法共分離純化獲得1 250株 供試細菌菌株。采用實驗室通用編號規(guī)則對其進行 編 號 并 于 - 80℃ 保 存 ，其 中 菌 株 HMB13496~ HMB13542、HMB15830~HMB15869、HMB20800~ HMB20868 和 HMB21265~HMB21493 共 385 株，自 棉花根圍土壤分離；菌株HMB21962~HMB22278和 HMB22870~HMB22926 共 374 株，自玉米根圍土壤 分離；菌株 HMB23318~HMB23448 和 HMB23606~ HMB23784 共 310 株，自番茄根圍土壤分離；菌株 HMB23807~HMB23987 共 181 株，自黃瓜根圍土壤 分離。在棉花盛鈴期，從河北省保定市高陽縣邢家 南鎮(zhèn)北于八村試驗棉田采集帶柄、健康、直徑約2.5 cm 的成鈴，備用。棉花品種為農(nóng)大棉8號。 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：20% 土豆煎汁、2% 葡萄糖、2% 瓊脂粉、蒸餾水1 000 mL；LB（Luria-Bertani）固體培 養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaCl、2%瓊脂 粉、蒸餾水1 000 mL；LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、 0.5%酵母粉、1% NaCl、蒸餾水1 000 mL。 藥劑、試劑及儀器：80%三乙膦酸鋁（phosethylAl）可濕性粉劑，浙江嘉華化工有限公司。細菌基因 組 DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公 司；PCR擴增試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒， 寶生物工程（大連）有限公司；rTaq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix ，寶生物工程（大連）有限公司；自制 的結(jié)晶紫染色液，將結(jié)晶紫2 g溶于20 mL 95%乙醇 中，取20 mL與1%草酸銨水溶液80 mL混勻置24 h 后過濾；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。BX63F正置熒 光顯微鏡，日本Olympus公司；2720型PCR儀，德國 Biometra 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠； GEN III-Omnilog型Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)，美 國 Biolog 公司；上海精宏SHP-080生化培養(yǎng)箱；ZQZY-80BS振蕩培養(yǎng)箱， 上海知楚儀器有限公司；VD-650-U潔凈工作臺，蘇 州安泰空氣技術(shù)有限公司。

采用平板對峙法（李社增等，2005b）測定1 250株 供試菌株對苧麻疫霉的拮抗作用。將4℃下保存的 苧麻疫霉轉(zhuǎn)接到PDA平板上，于25℃下培養(yǎng)3 d，在 苧麻疫霉菌落邊緣用直徑 6 mm 打孔器打取菌餅， 將苧麻疫霉菌餅轉(zhuǎn)接到另一個PDA平板中央，將活 化后的供試細菌菌株在距苧麻疫霉菌餅 20 mm 處 點接接種，以不接種任何供試細菌菌株的苧麻疫霉 為空白對照。25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，測量苧麻疫霉正 常生長半徑、抑制生長半徑和抑菌帶，計算抑菌率， 抑菌率=（正常生長半徑-抑制生長半徑）/正常生長 半徑×100%。以抑菌帶和抑菌率為指標(biāo)初步篩選對 苧麻疫霉有較好拮抗作用的供試菌株。 將-80℃下保存的苧麻疫霉拮抗菌菌株轉(zhuǎn)接到 LB固體培養(yǎng)基試管斜面上活化，24 h后挑取單菌落 接入裝有 100 mL LB 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶 中，在振蕩培養(yǎng)箱中于 170 r/min、30℃條件下培養(yǎng) 48 h，用 LB 固體平板培養(yǎng)基檢測培養(yǎng)液中菌體數(shù) 量，用無菌 0.9% 生理鹽水將其調(diào)配成濃度為 1.0× 107 CFU/mL的細菌培養(yǎng)液。

稱取1 g 80%三乙膦酸鋁可濕性粉劑，放入1 L 的玻璃量杯中，加入100 mL無菌水，玻璃棒攪拌使 之溶解，再加入400 mL無菌水即配制成80%三乙膦 酸鋁可濕性粉劑500倍藥液。 對初步篩選的供試菌株進行室內(nèi)篩選。采用離 體棉鈴人工接種病原菌。將田間采集的健康帶柄棉 鈴用75%酒精進行表面滅菌，并將棉鈴固定在長40 cm、 寬25 cm的長方形白色泡沫板上，室溫下晾干。每 塊泡沫板平均分為8列，每列平均固定5個棉鈴，共 40個棉鈴，每2 列的10個棉鈴為1個處理的1次重 復(fù)。在每個棉鈴表面噴施濃度為 1.0×107 CFU/mL 供試拮抗細菌培養(yǎng)液1 mL，以每個棉鈴噴施80%三 乙膦酸鋁可濕性粉劑500倍藥液1 mL為化學(xué)藥劑對 照，噴施等量蒸餾水為空白對照，噴施不同處理藥劑 時用擋板將其它棉鈴隔開，保證藥液噴施在10個目 的棉鈴表面，每個處理重復(fù)4次。將固定有40個棉 鈴的泡沫板放入盛有 300 mL 無菌水、長´寬´高為 42.0 cm´27.5 cm´10.5 cm 的保濕培養(yǎng)盒內(nèi)，用保鮮 膜封嚴(yán)保濕，置于25℃人工氣候室恒溫培養(yǎng)。24 h 后打開保濕培養(yǎng)盒，在每個棉鈴鈴縫中上部用消毒 針刺 3 個小孔，深度 3 mm，將在 PDA 培養(yǎng)基上于 25℃培養(yǎng)5 d的苧麻疫霉菌落用打孔器打取直徑為6 mm的菌餅，貼接在棉鈴鈴縫針孔處，繼續(xù)保濕培養(yǎng)。

1 250 株作物根圍細菌中共篩選到 399 株對 苧麻疫霉有較好拮抗作用的供試菌株，其中抑菌帶大于等于 9.0 mm 的菌株有 40 株，抑菌帶大于等于 10.0 mm 的 菌 株 有 11 株 ，抑 菌 率 達 到 80.00%~ 85.71%，其中菌株 HMB22922 對苧麻疫霉抑 菌率最高，為85.71%，抑菌帶寬10.0 mm。對初步篩選的 11 株供試菌株進行室內(nèi)篩選。 人工接種病原菌后，棉鈴疫病發(fā)病迅速，其中10株 供試菌株對棉鈴疫病表現(xiàn)一定的防治效果。 接種后5 d時，空白對照的病情指數(shù)達到14.38，噴施 菌株HMB22922、菌株HMB23917、菌株HMB21405 細菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)和化學(xué)藥劑之間差異不 顯著，但均顯著低于空白對照（P<0.05），防治效果分別達到 73.92%、69.58%、56.54% 和 70.72%；噴施其 它7株菌株細菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)與空白對照 之間差異不顯著。接種7 d后，空白對照病情指數(shù)為46.88，噴施菌 株HMB22922、菌株HMB21405、菌株HMB23917細 菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)和化學(xué)對照藥劑之間差異 仍然不顯著，但均顯著低于空白對照（P<0.05），對棉 鈴疫病的防治效果分別為 81.34%、66.67%、64.60% 和 71.11%；噴施菌株 HMB23319、菌株 HMB22277、 菌株 HMB20802 和菌株 HMB23707 細菌培養(yǎng)液棉 鈴的病情指數(shù)顯著低于空白對照（P<0.05），對棉鈴 疫病的防治效果在34.67%~49.34%之間；噴施菌株 HMB20803、菌株 HMB20826 和菌株 HMB23663 細 菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)與空白對照之間差異不顯 著，對棉鈴疫病的防治效果在20.01%~29.34%之間。

拮抗作用是生防細菌發(fā)揮生物防治效果的主要 機制之一，通過拮抗活性測定初步篩選生防細菌是 目前最普遍的方法（張斌等，2015）。由于棉鈴疫病 的主要病原菌苧麻疫霉可以離體培養(yǎng)，本研究采用 對峙培養(yǎng)法進行棉鈴疫病生防細菌的初步篩選，共獲得11株拮抗活性較強的拮抗細菌。然而眾多研 究表明，離體拮抗活性較強的細菌在田間未必表現(xiàn) 出較好的生物防治效果（劉郵洲等，2012），因為有些 細菌抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生受培養(yǎng)條件的影響，在PDA培 養(yǎng)基上可以產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，但在棉鈴上未必產(chǎn)生 或產(chǎn)生的濃度不足以抑制病原菌。另外，防治效果較好的生防細菌往往是多個生防作用機理綜合表現(xiàn) 的結(jié)果，包括抑菌作用（Kumar et al.，2011）、競爭作 用（Yánez-Mendizábal et al.，2012）以及誘導(dǎo)植物抗 病性（Kloepper et al.，2004；Lahlali et al.，2013）等。 本研究針對初步篩選的11株拮抗細菌進行了離體 防治效果和田間防治效果評價，發(fā)現(xiàn)只有拮抗細菌 HMB22922在田間表現(xiàn)出較好的防治效果。本研究 已明確 HMB22922 菌株對苧麻疫霉有很好的抑菌 作用，該菌株對苧麻疫霉是否產(chǎn)生競爭作用，對棉花 植株是否產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性作用仍需深入研究。

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